近年來，隨著石墨烯研究熱潮的興起，將石墨烯用于生物及化學檢測的工作也日益增多。本文著重介紹了基于石墨烯及氧化石墨烯(GO)的光學生物傳感器，特別是基于石墨烯的熒光共振能量轉移(FRET)傳感器以及比色法傳感器的設計思想和傳感特性。

　　1、引言

　　石墨烯是一種由純碳原子的六元環平面結構構成的二維材料，是零維的富勒烯、一維的碳納米管(CNTs)以及三維石墨結構的構筑基元。它具有非常大的理論比表面積、很高的楊氏模量、超高的光學透過率、優良的導熱性和導電性，并能夠通過電子轉移實現熒光猝滅。目前，人們已將基于石墨烯的材料廣泛應用于諸多領域，如吸附劑、催化劑、藥物載體等。石墨烯具有的奇特性質，使得其能夠滿足高靈敏性傳感器設計的需求，并已用于構建光學、電化學及場效應傳感器、細胞標記及實時監測等。本文紹了基于石墨烯材料的光學生物傳感器的研究進展，重點評述了基于石墨烯基的熒光共振能量轉移(FRET)以及比色法傳感器。

　　2、基于石墨烯的熒光共振能量轉移傳感器

　　熒光共振能量轉移(FRET)是能量由供體熒光團經無輻射途徑轉移給受體熒光團，并引起供體熒光猝滅和受體熒光增強的光學現象，是測量活體及體外納米尺度距離及變化的有效手段。近年來，人們致力于開發基于石墨烯材料的FRET傳感器，將其用于生物及化學檢測。FRET傳感器主要由3部分構成:供體、受體(猝滅劑)及供受體之間的橋聯媒介。在基于石墨烯的FRET傳感器中，石墨烯及其衍生物既可以作為供體，又可作為受體。一方面，石墨烯由于其結構特點，能夠同時猝滅發射波長或結構不同的多種熒光團的熒光，是一種通用的猝滅劑;另一方面，石墨烯及其衍生物經過一定的化學處理，可以產生熒光信號，可作為熒光供體。基于石墨烯的FRET生物傳感器依托于一些生物分子構建的橋聯基，用于調節供體熒光團和受體之間的距離，從而引起熒光的變化。其中，DNA、蛋白質、多肽等生物分子均可以作為橋聯基。

　　2.1、以石墨烯作為猝滅劑

　　在報道的基于石墨烯材料的FRET傳感器中，以石墨烯材料作為猝滅劑的居多。氧化石墨烯(GO)是石墨烯的一種重要衍生物，是化學還原法制備石墨烯的前驅體，在石墨烯片層結構的邊緣和表面帶有多種含氧基團，如羧基、羥基、環氧基等。正是由于這些含氧基團的存在，使其較石墨烯具有更好的水溶性，可以應用于生物體系中。石墨烯及GO由于其大面積的共軛結構，可以作為能量受體猝滅多種有機染料及量子點的熒光，是一種廣適性的熒光猝滅劑。與傳統的猝滅劑相比，石墨烯材料具有更高的猝滅效率，使FRET傳感器具有背景低、信噪比高、可多重檢測的顯著特點。

　　2.1.1、基于DNA聯接研究表明，石墨烯能區分多種DNA分子結構，包括ssDNA，dsDNA以及莖環結構等。石墨烯及GO由于其結構特點，對帶有裸露的環狀結構的化合物具有強烈的吸附能力。

　　DNA中的堿基包含六元環結構，石墨烯會與裸露的堿基發生強烈的π-π相互作用、疏水作用等，從而吸附DNA。但是石墨烯與不同分子結構的DNA的結合能力明顯不同。對于相同堿基數量的單鏈DNA(ssDNA)和雙鏈DNA(dsDNA)，石墨烯能夠穩定吸附ssDNA，而對dsDNA的吸附能力則較弱。其原因是由于DNA雜交后空間結構發生改變，磷酸鹽骨架將堿基有效屏蔽在其中，使石墨烯無法與堿基接觸，從而造成結合能力的減弱。DNA一級結構的差異也會導致與石墨烯的結合能力不同，堿基數量越多的ssDNA與石墨烯材料的結合能力越強。正是基于石墨烯對不同結構的DNA的吸附能力有所區別，研究者們構建了一系列以DNA聯接的石墨烯基FRET傳感器。

　　(1)利用DNA互補序列2009年，Lu等首次報道了基于石墨烯的FRET生物傳感器。該傳感器是由標記了羧基熒光素(FAM)的ssDNA與GO構成。在沒有目標DNA時，FAM-ssDNA會吸附到GO表面，造成FAM與GO之間發生FRET，使FAM熒光團的熒光被迅速猝滅;而當FAM-ssDNA與目標DNA雜交后，會改變DNA的構型并且削弱了FAM-ssDNA與GO之間的相互作用，這就造成FAMssDNA從GO表面釋放出來，增大FAM與GO之間的距離，阻礙FRET，造成FAM熒光恢復。從而建立了一種用于檢測特定DNA序列的高靈敏度及選擇性的熒光恢檢測方法。該課題組還運用GO作為納米猝滅劑構建了一種分子信標(MB)探針。傳統的分子信標探針兩端分別標記熒光團和猝滅團。而這種新型的分子信標探針則只需在一端標記熒光團，而猝滅劑GO則不需要標記。與傳統的分子信標相比，該探針不需要復雜的合成步驟，同時猝滅更有效、靈敏度更高。更重要的是，由于發卡狀的DNA在GO表面的構象約束大大提高了該探針對單堿基錯配的選擇性識別能力。其后相繼出現了以量子點(QDs)或Ag納米簇[20]標記的ssDNA探針作為信號報告基團，以GO作為猝滅劑，以類似的模型構建FRET傳感器，用于特定DNA序列的檢測。GO能夠同時猝滅標記ssDNA探針的不同顏色的熒光，可利用此性質識別多種與ssDNA探針互補的特定DNA序列，實現在同一溶液中檢測多種特定DNA序列。Zhang等構建了免標記的石墨烯FRET傳感器，用于DNA特定序列的檢測。當體系中不存在目標ssDNA時，探針ssDNA及所用的DNA嵌插染料(SYBRGreenI，SG)都吸附在石墨烯表面;當引入目標ssDNA時，由于形成dsDNA，并且SG與dsDNA內嵌結合，從而遠離石墨烯表面，使熒光恢復。

　　(2)利用DNA錯配DNA在通常情況下遵循堿基互配的原則，即腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)、鳥嘌呤-胞嘧啶(G-C)配對。但是在某些離子存在情況下，會有錯配發生，較為常見的有C-Ag+-C和T-Hg2+-T錯配。將DNA錯配與石墨烯FRET傳感器結合，可以實現特定離子的檢測。Wen等利用熒光標記的富含C的ssDNA構建了Ag+的熒光傳感器。Ag+的引入可以引起富含C的ssDNA構型的變化，當體系中沒有Ag+時，DNA為柔軟的單鏈結構;當有Ag+存在時，C與Ag+發生絡合形成C-Ag+-C，DNA鏈形成剛性的發卡dsDNA結構。DNA結構的改變使DNA與GO的相互作用發生改變，從而引起體系熒光改變。Liu等也構建了類似的平臺，利用半胱氨酸(Cys)與C-C錯競爭結合Ag+，實現對Cys的檢測。他們首先用足量的Ag+使富含C的ssDNA發生折疊，形成dsDNA結構，使體系具有熒光。Cys的加入會奪取C-Ag+-C中的Ag+，使dsDNA結構恢復成ssDNA結構，吸附在GO表面，造成熒光猝滅，其熒光猝滅的程度與Cys的濃度成正比。Zhang等則選用一條標記了熒光且富含T的ssDNA，利用THg2+-T錯配，使ssDNA折疊成dsDNA結構，所以Hg2+的加入會使最初較低的熒光信號增強。而碘化物比T-T錯配具有更高的與Hg2+結合的能力，碘化物的加入會造成熒光信號的再次猝滅。從而利用GO作為信號變化器，以Hg2+和碘化物作為激活劑構建了一個簡單可靠的熒光DNA邏輯門。

　　(3)利用核酸適配體核酸適配體是一種功能性核酸，它是一段篩選出來的ssDNA序列，能夠特異性結合蛋白質、小分子或者離子，可作為便利的傳感元件使用。核酸適配體與其特異性目標物結合會使其構型發生改變，單鏈結構發生折疊，阻礙核酸序列中堿基與石墨烯接觸，引起二者距離的改變。例如，選用熒光標記的凝血酶核酸適配體構建FRET傳感器用于凝血酶的檢測。首先，熒光標記的凝血酶核酸適配體與石墨烯以非共價鍵結合，發生能量轉移，造成體系熒光猝滅;然后向體系中加入凝血酶，該核酸適配體會特異性結合凝血酶，形成四鏈體-凝血酶結構，該結構與石墨烯的作用力較弱，最終造成體系熒光恢復。這種石墨烯-核酸適配體傳感器無論是在緩沖溶液還是血清中均表現出優異的靈敏度和選擇性。文獻中報道了多種基于石墨烯的核酸適配體FRET傳感器，分別用于赭曲霉素A、三磷酸腺苷(ATP)以及粘蛋白(MUC1)等物質的檢測。由于核酸適配體能夠選擇性識別目標物質，區別其它結構類似物，所以核酸適配體傳感器都具有較好的選擇性，可用于檢測稀釋的實際樣品中的待測物，如稀釋的血清、細胞提取液、紅酒等。文獻中也報道了無標記的核酸適配體傳感器。吖啶橙(AO)由于其結構特點能夠吸附在還原的GO(rGO)表面，造成AO熒光猝滅。而G-四鏈體結構的核酸適配體(PS.M)能夠捕獲吖啶橙，使AO從rGO表面脫離，恢復熒光。但是向AO-PS.M/GO混合液中加入血紅素時，PS.M就會與血紅素發生特異性結合，釋放出AO，AO再次與GO結合導致熒光猝滅。該方法實現了血紅素無標記定量檢測，檢出限為50nmol/L。

　　(4)利用脫氧核酶(DNAzyme)DNAzyme也是一種功能性核酸，具有催化功能以及識別目標分子的能力。DNAzyme可以與其對應的基底形成DNAzyme-基底雜化體，在特定離子的共同作用下，DNAzyme發揮其催化活性，將基底從斷裂位點上剪切開。Zhao等報道了一種基于GO-DNAzyme的Turn-on傳感器，用于Pb2+的熒光放大檢測。該傳感器中以FAM標記的GR-5DNAzyme-基底雜化體作為分子識別模塊及信號指示器，以GO作為猝滅劑。GR-5DNAzyme表現出更高的信噪比及更好的選擇性。與之相反，Wen等則利用8-17DNAzyme構建了一種Pb2+的Turn-off熒光傳感器。同樣，采用Cu2+依賴的標記FAM的DNAzyme與石墨烯自組裝就可以構建用于檢測Cu2+的DNAzyme傳感器。文獻中也報道了無標記的DNAzyme石墨烯傳感器模型。Liu等利用嵌插染料GelRed標記Cu2+依賴的DNAzyme的雙鏈或三鏈區域。GelRed起初只有微弱的熒光，當插入DNAzyme的雙鏈或三鏈區域會發出強烈的熒光。當引入石墨烯后，DNAzyme會與GO自組裝形成GelRed-DNAzyme-石墨烯復合物，造成熒光猝滅。由于該DNAzyme的催化活性依賴Cu2+，所以當體系中有Cu2+存在時，該DNAzyme會發生斷裂，釋放出GelRed，導致熒光信號增強。該方法可用于多種待測物的分析。

　　(5)利用核酸水解酶在核酸水解酶(核酸外切酶或核酸內切酶)的作用下發生的酶切反應會使原有的DNA分子鏈斷裂，從而改變其分子構型。例如，脫氧核糖核酸酶I(DNaseI)是一種核酸內切酶，它能夠非特異性將DNA剪切成寡核苷酸;但是DNaseI只作用于ssDNA、dsDNA以及DNA/RNA復合物中的DNA鏈，卻不能作用于RNA。以DNaseI與GO保護的ssDNA探針構成的FRET體系可以用于microRNAs(miRNA)的信號放大檢測。其原理是當沒有miRNA時，熒光標記的ssDNA探針會吸附在GO上造成熒光猝滅;在加入miRNA后，ssDNA會從GO表面脫附并與miRNA形成復合物，同時熒光恢復。此時，RNA/DNA復合物立即成為DNaseI的消化基底，由DNaseI剪切其中的DNA鏈，從而釋放出

　　miRNA，釋放出的miRNA會與另外的ssDNA探針結合，進入下一輪的剪切循環。該循環一直持續到消耗完所有的探針，所有熒光恢復，達到熒光信號顯著放大的作用。這樣利用多色熒光標記的ssDNA探針就可同時檢測多種不同的miRNA。Lin等以GO和λ核酸外切酶酶切反應為基礎建立了一種簡單、精確測定多核苷酸激酶(PNK)活性的方法。首先，熒光標記的dsDNA與GO混合時，體系具有熒光。但是當dsDNA被PNK磷酸化后，λ核酸外切酶會立即從末端剪切dsDNA，剪切后的片段就會吸附在GO表面，造成熒光猝滅;反之，如果體系中沒有PNK或者PNK活性被抑制，則不會發生剪切反應，體系熒光仍保持。Lee等則利用只剪切dsDNA而不剪切ssDNA的核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)作用于5'端標記熒光的發卡型DNA。ExoⅢ從3'端剪切dsDNA直至dsDNA盡，只剩ssDNA，從而造成有熒光標記的一段ssDNA序列吸附在GO表面，引起體系熒光猝滅，從熒光猝滅的程度可以衡量核酸外切酶的活性。

　　(6)其它方法Wu等[39]利用解鏈溫度的差異，設計了一種用于分析DNA磷酸化反應的石墨烯分子信標，該分子信標可以測量T4多核苷酸激酶(PNK)的活性，對單堿基差異具有高特異性識別能力。該實驗中用到了兩條寡核苷酸(A，B)以及一個發卡序列DNA。其中A，B能夠組成與發卡DNA完全匹配的序列，但是A具有5'-羥基端、B兩端都為羥基端。當有PNK存在時，A和B兩條DNA鏈會發生連結，與發卡DNA構成穩定的雙鏈結構，該雙鏈結構具有較高的解鏈溫度，在50℃時體系具有較強熒光。但沒有PNK存在時，A和B兩條DNA與發卡DNA發生雜交，形成有可連結缺口的雙鏈結構，導致該雙鏈DNA的解鏈溫度較低，在50℃時解鏈形成游離的發卡DNA的熒光會被GO猝滅，基于此原理就可以檢測T4PNK的活性。Wu等[40]則利用了DNA的三級結構變化，構建FRET傳感器，用于檢測猴病毒(SV40)中同型嘌呤同型啶dsDNA結構。這段具有17個堿基對的dsDNA結構很容易與熒光標記的ssDNA結合形成三螺旋DNA，使ssDNA從GO表面脫離，造成體系熒光恢復。Li等[41]利用博來霉素和Fe2+共同作用使ssDNA斷裂，造成較短的ssDNA鏈段從GO表面的釋放，使體系熒光增強。該方法能夠特異性檢測博來霉素的含量。

　　上文介紹了一系列以DNA結構單一改變為基礎的石墨烯FRET傳感器。Zhang等充分利用DNA不同的構型變化，在同一溶液中建立了一種多元檢測方法。該體系中含有多種熒光標記的DNA探針，包括特定序列的ssDNA、核酸適配體、富含胞嘧啶(C)和富含胸腺嘧啶(T)的ssDNA，每種探針以不同顏色的熒光團標記。利用石墨烯超強的猝滅效率，實現了同一溶液中對多種目標物的同時檢測。